微生物向专家求助。首先,他们感谢了一个已知序列的小抗菌肽,并讨论了如何用生物工程技术表达它。

这是一道作文题。我根据我的理解为你解答一下,希望能给你一些帮助。

首先要知道抗菌肽的表达系统是真核还是原核。回答问题的思路是:

1.用genbank搜索已知序列,如果没有,就需要自己测序。

2.分别检测N端和C端的15个氨基酸序列,根据密码子简并性和偏好性设计引物。

3.设计引物后,提取总RNA,通过RT-PCR扩增抗菌肽基因。

4.测序:将目的基因连接到T载体上,转化到克隆菌(如TG1)中,用蓝白点筛选,PCR和酶切鉴定重组结果,以重组质粒为模板测序,验证目的基因的准确性。

5.选择合适的表达系统和载体。可利用大肠杆菌原核表达系统,从带有T载体的重组质粒中双酶切出目的基因,然后连接到合适的载体(如pET28a),转化到克隆菌(如TG1)中,进行大量克隆。通过酶消化和PCR鉴定重组结果。也可以使用真核表达系统。如果修饰后的抗菌肽是真核表达蛋白,翻译后容易被糖基化和修饰,那么用原核表达系统很难表达出与天然产物结构和功能相似的蛋白。因此,采用真核表达系统。通过位点特异性转座,可以很容易地将外源基因插入到病毒穿梭载体中,然后提取含有外源基因的重组DNA,转染到昆虫细胞中,获得含有外源基因的重组病毒,用于表达目的蛋白。

6.产物的表达、分离和纯化。原核表达系统是将重组质粒转化到合适的大肠杆菌表达菌(如BL21、BL21*等)中。),加入IPTG诱导剂诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物,超声诱导细菌,分别对上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳,确定蛋白是上清蛋白还是包涵体,然后根据蛋白表达模式采取相应的方法。含有外源基因的家蚕杆状病毒也可用于感染家蚕幼虫或蛹进行真核表达,表达的蛋白具有天然活性。

7.确保活动始终如一。成年新西兰兔用免疫手段多次皮下注射乳化纯化蛋白,获得相应抗体。通过Western blot和Elisa,目的蛋白与抗体发生特异性结合,用Elisa检测抗体的效价,以保证活性一致。

希望能给你一些帮助。